實驗原理

　　細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196~C液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。 細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，細胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。

　　目前常用的保護劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

　　實驗材料

　　儀器：MVE液氮罐、凍存管(塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機等

　　試劑：0.25%胰酶、培養(yǎng)基、含保護劑的培養(yǎng)基(即凍存液)

　　附：凍存液配制：培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5-20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。

　　實驗步驟

　　1.消化細胞，將細胞懸液收集至離心管中。

　　2.1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

　　3.沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。

　　4.將懸液分至凍存管中，每管1ml。

　　5.將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。

　　6.貼上標(biāo)簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。

　　7.按下列順序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。

　　注意：操作時應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。MVE液氮罐